Die Sanger-Sequenzierung ist eine Methode zur Bestimmung der Basenabfolge der DNA. Entwickelt in den 1970er Jahren von dem britischen Biochemiker Frederick Sanger, revolutionierte sie die Molekularbiologie und Genetik grundlegend. Noch heute gilt sie in der medizinischen Diagnostik als Goldstandard und das aus gutem Grund: Kaum eine andere Methode erreicht ihre Präzision beim Lesen einzelner DNA-Abschnitte.

Obwohl modernere Hochdurchsatzverfahren wie das Next Generation Sequencing (NGS) und das Third Generation Sequencing (TGS) inzwischen weit verbreitet sind, bleibt die Sanger-Sequenzierung als erste Generation der Sequenziertechnologie ein unverzichtbares Werkzeug im Laboralltag. Sie wird insbesondere eingesetzt zur:

• Bestätigung genetischer Varianten, die durch NGS oder TGS identifiziert wurden
• Diagnostik monogener Erkrankungen, bei denen nur ein einzelnes Gen untersucht werden muss
• Einzelgen-Tests mit klar umgrenzter Fragestellung

Im Vergleich zu modernen Sequenzierverfahren ist die Sanger-Sequenzierung bei größeren Genmengen zeitaufwendiger und kostenintensiver, weshalb sie heute vor allem dort eingesetzt wird, wo Präzision Vorrang vor Geschwindigkeit hat. Die Länge der am Stück gelesenen Sequenz ist abhängig von der Länge der benutzten Kapillare. Beispielsweise ist in unserem Labor eine Länge von etwa 1000 – 800 Basenpaare möglich.

Die Sanger-Sequenzierung basiert auf der  Kettenabbruchmethode, einer speziellen Form der Polymerasekettenreaktion (PCR), die in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten abläuft. Der gesamte Prozess wird viele Male zyklisch wiederholt, sodass am Ende eine große Menge unterschiedlich langer DNA-Fragmente entsteht, aus denen die Basenabfolge abgelesen werden kann.

1. Denaturierung

Am Anfang liegt die zu untersuchende DNA als Doppelstrang vor, deren Stränge durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten werden. Durch Erhitzen auf etwa 94 °C werden diese Bindungen aufgebrochen, und der Doppelstrang trennt sich in zwei separate Einzelstränge. Dieser Schritt wird als Denaturierung bezeichnet.

2. Annealing (Primerbindung)

Im zweiten Schritt wird die Temperatur auf etwa 60 °C abgesenkt. Dadurch können sich sogenannte Primer (kurze, künstlich hergestellte DNA-Stücke) gezielt an die komplementären Bereiche der Einzelstränge anlagern. Die Primer markieren den genauen Startpunkt der DNA-Synthese.

3. Extension (Verlängerung)

Bei etwa 72 °C beginnt die eigentliche Synthese des neuen DNA-Stranges. Das Enzym Taq-Polymerase heftet ausgehend vom Primer Baustein für Baustein an den Einzelstrang und ergänzt diesen zum Doppelstrang.

Als Bausteine stehen zwei Typen zur Verfügung:

• dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate): die natürlichen DNA-Bausteine, die eine kontinuierliche Verlängerung des Stranges ermöglichen
• ddNTPs (Didesoxyribonukleosidtriphosphate): fluoreszenzmarkierte Bausteine, bei denen am 3‘-Kohlenstoffatom des Zuckers die Hydroxygruppe fehlt. Das heißt wenn ein ddNTP anstelle eine dNTP eingebaut wird, kann kein weiteres Nukleotid angefügt werdenwodurch es zum sogenannten Kettenabbruch kommt. Der fluoreszierende Farbstoff ermöglicht eine Visualisierung des zuletzt eingebauten Nukleotids.
  • Da ddNTPs zufällig eingebaut werden, entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. Jedes endet mit einem fluoreszierenden ddNTP, das der jeweils letzten Base entspricht. 

4. Auftrennung

Die entstandenen DNA-Fragmente werden anschließend mithilfe einer Kapillarelektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Dabei wandern die Fragmente durch ein feines Gel, wobei kleinere Fragmente schneller wandern als größere. Da sich die Fragmente jeweils um genau eine Base in ihrer Länge unterscheiden, lassen sie sich so exakt sortieren.

5. Detektion und Auswertung

Im letzten Schritt regt ein Laser die fluoreszenzmarkierten Stopp-Bausteine (ddNTPs) am Ende jedes Fragments zur Emission von Licht an. Da jede der vier DNA-Basen (Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin) mit einem anderen Farbstoff markiert ist, leuchtet jedes Fragment in einer charakteristischen Farbe (rot, blau, grün oder schwarz). Ein Detektor erfasst die Lichtsignale in der Reihenfolge, in der die Fragmente das Ende der Kapillare passieren, und übersetzt diese automatisch in die zugehörige Basenabfolge.